Amyloïdose is een aandoening die wordt gekenmerkt door de abnormale extracellulaire depositie van eiwitfibrillen.^{1, 2} De ziekte treedt op wanneer een precursoreiwit zijn natieve substructuur verliest, een aberrante bèta-sheetconfiguratie verwerft, neerslaat en daarbij de werking van cellen en weefsels verstoort. Verschillende organen kunnen worden aangetast bij systemische amyloïdose. In het hart leidt de aandoening tot progressieve restrictieve cardiomyopathie³, verminderde hartfunctie, geleidingsstoornissen, ritmestoornissen, kleplijden en/of rechtszijdig hartfalen.⁴ Twee belangrijke types amyloïd veroorzaken meer dan 95 % van de gevallen van cardiale amyloïdose, met name lichteketenamyloïdose (AL) en transthyretineamyloïdose (TTR). Lichteketenamyloïdose kan optreden wanneer de patiënt een plasmacelkloon heeft die een amyloïdogeen lichteketen deel produceert. Transthyretineamyloïdose kan voorkomen in verworven vorm (bij oudere patiënten, zogenaamde 'seniele' amyloïdose) of in het kader van een erfelijke genetische aandoening.^{2, 5-7} Hoewel zeldzaam4, wordt cardiale amyloïdose de laatste jaren meer vastgesteld dankzij betere bewustwording en betere diagnostische technieken^8-10 (figuur 1). De beschikbaarheid van nieuwe therapieën of therapie-indicaties (bijvoorbeeld transthyretinestabilisatoren of -verwijderaars, doelgerichte plasmacelinhibitoren of orgaantransplantatie) leidt bovendien tot een toegenomen vraag tot exacte typering van de amyloïdneerslagen^{11, 12}, typisch op basis van een weefselbiopsie.^{5, 13} In dit artikel lichten we toe hoe de patholoog amyloïdose in het hart diagnosticeert en typeert. We schetsen bovendien wat de bijdrage van massaspectrometrie-gebaseerde proteoomanalyse kan zijn, een moderne analytische techniek die meer en meer wordt gebruikt voor klinische diagnostiek.

Histologische methodes voor het aantonen en typeren van amyloïd

Histologisch onderzoek is nog steeds de gouden standaard voor diagnose van amyloïdose.^{6, 14, 15} Afname van de endomyocardiale biopsie gebeurt tijdens een rechterhartkatheterisatie. Hiervoor worden minstens drie prelevementen genomen vanuit het septum van het rechterventrikel. De biopten worden het liefst vers of gekoeld (0-4 °C) naar een nabijgelegen laboratorium pathologie met ervaring in diagnostiek van amyloïdose gebracht. De biopten mogen daarbij niet uitdrogen. Dit kan men verwezenlijken door een vochtig gaasje naast de biopten in het potje te leggen. Vers transport laat toe dat een van de biopten kan worden ingevroren voor immuunfluorescentie. De andere twee biopten worden dan gefixeerd in gebufferde formol en verwerkt tot paraffineblokjes en -coupes. Een volledig ingevuld bijgevoegd aanvraagformulier met klinische inlichtingen is essentieel.

De patholoog beoordeelt de biopten, gekleurd met onder andere een congoroodkleuring, onder de microscoop.^{16, 17} Congorood bindt zich aan amyloïde fibrillen en toont een typische oranjerode kleur die verandert naar groen onder gepolariseerd licht.¹⁵ Ondanks het feit dat de endomyocardiale biopsie een invasieve techniek is, is ze veel sensitiever dan extracardiale biopten (zoals biopten uit het abdominale vet en beenmerg) voor de diagnose van systemische amyloïdose.¹⁸

Waar een congoroodkleuring amyloïddeposities kan detecteren in biopten, kan immuunhistochemie het aangetroffen amyloïd helpen typeren (figuur 1). Immuunhistochemie is een techniek waarbij gebruik gemaakt wordt van een kleurstof gebonden aan specifieke monoklonale antilichamen om bepaalde eiwitten of epitopen te visualiseren. Op deze manier kunnen ook transthyretine of lichte ketens worden aangetoond. De techniek is goed ingeburgerd en goedkoop. Het nadeel is dat de gevoeligheid en de specificiteit bij amyloïdose variabel is, omdat er aspecifieke aankleuring kan optreden. Zowel lichte ketens als transthyretine zijn immers moleculen die ook overvloedig in het bloed voorkomen.^19-21 De meeste laboratoria hebben bovendien geen antilichamen in huis voor de zeldzame subtypes, zodat de types amyloïdose ApoAI, APoAIV en AFib ondergedetecteerd blijven.^{22, 23} Uit de literatuur blijkt dan ook dat immuunhistochemie er in 20-25 % van de gevallen niet in slaagt amyloïd correct te typeren.²² Een alternatief voor immuunhistochemie is het gebruik van immuno-elektronenmicroscopie^{14, 18, 24}, waarbij het probleem van achtergrondkleuring verdwijnt. Echter ook hier blijven zeldzame types ondergedetecteerd door nood aan speciale reagentia.

Lasermicrodissectie en massaspectrometrie- gebaseerde proteoomanalyse

Een interessant alternatief voor de diagnose van amyloïdose is massaspectrometrische proteoomanalyse van weefselbiopten.

Bij deze techniek worden eerst alle eiwitten uit de paraffine weefselcoupes geëxtraheerd in een detergentrijke buffer, met behulp van warmte en ultrasonicatie (HYPERsol-protocol) (figuur 3). Om de gevoeligheid te verhogen kunnen vooraf de zones met amyloïddeposities uit de paraffinecoupes van het endomyocardbiopt worden gesneden door middel van lasermicrodissectie.¹⁶ Hierbij worden congoroodgekleurde regio's onder de microscoop losgemaakt met een laser en specifiek gecollecteerd. Nadien worden de geëxtraheerde eiwitten geïdentificeerd met behulp van liquid chromatografie-tandem mass spectrometry of LC-MS/MS.²⁵

Voor LC-MS/MS-analyse worden de eiwitten enzymatisch verknipt in kortere peptiden. Deze peptiden worden vervolgens gescheiden op basis van hydrofobiciteit op een vloeistofchromatograaf (liquid chromatography of LC) gekoppeld aan een massaspectrometer. De peptiden die elueren van de chromatografische kolom worden onmiddellijk geïoniseerd voor massabepaling op de gekoppelde massaspectrometer. Dit toestel voert twee soorten massametingen uit (tandem mass spectrometry of MS/MS). Enerzijds wordt de massa gemeten van de intacte peptiden, anderzijds worden de peptiden ook gefragmenteerd en wordt de massa van de resulterende fragmenten gemeten (figuur 3). Uit beide types massaspectra kan gespecialiseerde software nadien de sequentie van de peptiden achterhalen samen met de identiteit van de precursoreiwitten. Op die manier wordt dus een overzicht bekomen van de eiwitten aanwezig in het weefsellysaat samen met een indicatie van de abundantie waarmee ze werden teruggevonden. In sommige studies kan men middels de toevoeging van een gespecialiseerde softwarepipeline zelfs ook het onderscheid maken tussen de hereditaire en de verworven vorm van transthyretineamyloïdose.²⁶

Recente proteomische studies over subtypering van cardiale amyloïdose

De meeste studies bevestigen de meerwaarde van LC-MS/MS-analyse voor de diagnostiek van amyloïdose, met verbetering in sensitiviteit en specificiteit ten opzichte van immuunhistochemie (tabel 1).

LC-MS/MS-analyse maakt momenteel evenwel geen deel uit van de routinediagnostiek in België, hoewel meerdere universitaire centra, waaronder UZ Gent-VIB, een pijplijn aan het ontwikkelen zijn. Het blijft een relatief dure en arbeidsintensieve diagnostische test. Desalniettemin biedt de LC-MS/MS-analyse perspectief voor gevallen waar de diagnose door middel van immuunhistochemie uitdagingen stelt of discordant is met de kliniek, zeker wanneer er significante (en vaak ook dure) behandelingsconsequenties aan vasthangen.

Samenvatting en discussie

Het ziekteverloop, de prognose en de therapie van cardiale amyloïdose is grotendeels afhankelijk van het type amyloïd. Lichtmicroscopisch onderzoek met congoroodkleuring en immuunhistochemie van weefselbiopten blijft ondanks de beperkingen (suboptimale sensitiviteit en specificiteit), een eerstelijnsmethode voor diagnose en subtypering. Bij bemoeilijkte diagnostiek kan massaspectrometrie-gebaseerde proteoomanalyse een waardevolle toevoeging zijn om het type amyloïd met een hoge mate van zekerheid te kunnen identificeren.¹⁹

Referenties

1. Martinez-Naharro, A., Hawkins, P.N., Fontana, M. Cardiac amyloidosis. Clin Med (Lond), 2018, 18, 30-35.
2. Garcia-Pavia, P., Rapezzi, C., Adler, Y., Arad, M., Basso, C., Brucato, A. et al. Diagnosis and treatment of cardiac amyloidosis: a position statement of the ESC Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. Eur Heart J, 2021, 42, 1554-1568.
3. Rubin, J., Maurer, M.S. Cardiac Amyloidosis: Overlooked, Underappreciated, and Treatable. Annu Rev Med, 2020, 71, 203-219.
4. Flodrova, P., Flodr, P., Pika, T., Vymetal, J., Holub, D., Dzubak, P. et al. Cardiac amyloidosis: from clinical suspicion to morphological diagnosis. Pathology, 2018, 50, 261-268.
5. Castiglione, V., Franzini, M., Aimo, A., Carecci, A., Lombardi, C.M., Passino, C. et al. Use of biomarkers to diagnose and manage cardiac amyloidosis. Eur J Heart Fail, 2021, 23 (2), 217-230.
6. Maleszewski, J.J. Cardiac amyloidosis: a clinical and pathological review. Diagn Histopathol, 2022, 28 (4), 181-191.
7. Maurer, M.S., Perry, E., Comenzo, R., Semigran, M., Rapezzi, C. Addressing Common Questions Encountered in the Diagnosis and Management of Cardiac Amyloidosis. Circulation, 2017, 135, 1357-1377.
8. Rossi, M., Varrà, G.G., Porcari, A., Saro, R., Pagura, L., Lalario, A. et al. Re-Definition of the Epidemiology of Cardiac Amyloidosis. Biomedicines, 2022, 10, 1566-1573.
9. Gilstrap, L.G., Dominici, F., Wang, Y., El-Sady, S., Singh, A., Carli, M.F.D. et al. Epidemiology of Cardiac Amyloidosis-Associated Heart Failure Hospitalizations Among Fee-for- Service Medicare Beneficiaries in the United States. Circ Heart Fail, 2019, 12 (6), e005407.
10. Bonderman, D., Pölzl, G., Ablasser, K., Agis, H., Aschauer, S., Auer-Grumbach, M. et al. Diagnosis and treatment of cardiac amyloidosis: an interdisciplinary consensus statement. Wien Klin Wochenschr, 2020, 132, 742-761.
11. Benson, M.D., Kluve-Beckerman, B., Zeldenrust, S.R., Siesky, A.M., Bodenmiller, D.M., Showalter, A.D. et al. Targeted suppression of an amyloidogenic transthyretin with antisense oligonucleotides. Muscle Nerve, 2006, 33, 609-627.
12. Varga, C., Dorbala, S., Lousada, I., Polydefkis, J.M., Wechalekar, A., Maurer, S.M. et al. The diagnostic challenges of cardiac amyloidosis: A practical approach to the two main types. Blood reviews, 2021, 45.
13. Hafeez, A.S., Bavry, A.A. Diagnosis of Transthyretin Amyloid Cardiomyopathy. Cardiol Ther, 2020, 9, 85-95.
14. Prochorec-Sobieszek, M., Bilińska, Z.T., Grzybowski, J., Michalak, E., Jakubowska, E., Sobieszczańska-Małek, M. et al. Cardiac amyloidosis diagnosed by endomyocardial biopsy. Clinical, histopathological, immunohistochemical and ultrastructural studies. Kardiol Pol, 2005, 63, 20-35.
15. Banypersad, S.M., Moon, J.C., Whelan, C., Hawkins, P.N., Wechalekar, A.D. Updates in cardiac amyloidosis: a review. J Am Heart Assoc, 2012, 1 (2), e000364.
16. Wisniowski, B., Wechalekar, A. Confirming the Diagnosis of Amyloidosis. Acta Haematol, 2020, 143 (4), 312-321.
17. Vrana, J.A., Gamez, J.D., Madden, B.J., Theis, J.D., Bergen, R., Dogan, A. Classification of amyloidosis by laser microdissection and mass spectrometry-based proteomic analysis in clinical biopsy specimens. Blood, 2009, 114 (24), 4957-4959.
18. Ash, S., Shorer, E., Ramgobin, D., Vo, M., Gibbons, J., Golamari, R. et al. Cardiac amyloidosis - A review of current literature for the practicing physician. Clin Cardiol, 2021, 44 (3), 322-331.
19. Röcken, C., Schwotzer, E.B., Linke, R.P., Saeger, W. The classification of amyloid deposits in clinicopathological practice. Histopathology, 1996, 29 (4), 325-335.
20. Röcken, C., Sletten, K. Amyloid in surgical pathology. Virchows Arch, 2003, 443 (1), 3-16.
21. Espina, V., Wulfkuhle, J.D., Calvert, V.S., VanMeter, A., Zhou, W., Coukos, G. et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc, 2006, 1 (2), 586-603.
22. Gilbertson, J.A., Theis, J.D., Vrana, J.A., Lachmann, H., Wechalekar, A., Whelan, C. et al. A comparison of immunohistochemistry and mass spectrometry for determining the amyloid fibril protein from formalin-fixed biopsy tissue. J Clin Pathol, 2015, 68 (4), 314-317.
23. Joury, A., Faaborg-Andersen, C., Quintana, R.A., daSilva-deAbreu, A., Nativi-Nicolau, J. Diagnostic Tools for Cardiac Amyloidosis: A Pragmatic Comparison of Pathology, Imaging and Laboratories. Curr Probl Cardiol, 2022, 101106.
24. Frenzel, H., Schwartzkopff, B., Kuhn, H., Lösse, B., Thormann, J., Hort, W. et al. Cardiac amyloid deposits in endomyocardial biopsies. Light microscopic, ultrastructural, and immunohistochemical studies. Am J Clin Pathol, 1986, 85 (6), 674-680.
25. Haver, D.V., Dendooven, A., Impens, F. Proteomics-based analysis and diagnosis of formalin-fixed paraffin-embedded amyloidosis samples. 2021.
26. Dasari, S., Theis, J.D., Vrana, J.A., Rech, K.L., Dao, L.N., Howard, M.T. et al. Amyloid Typing by Mass Spectrometry in Clinical Practice: a Comprehensive Review of 16,175 Samples. Mayo Clin Proc, 2020, 95 (9), 1852-1864.
27. Withers, B., McCaughan, G., Hayward, C., Kotlyar, E., Jabbour, A., Rainer, S. et al. Clinical characteristics and prognosis of cardiac amyloidosis defined by mass spectrometry-based proteomics in an Australian cohort. Intern Med J, 2020, 52 (1), 69-78.
28. Satoskar, A.A., Efebera, Y., Hasan, A., Brodsky, S., Nadasdy, G., Dogan, A. et al. Strong transthyretin immunostaining: potential pitfall in cardiac amyloid typing. Am J Surg Pathol, 2011, 35 (11), 1685-1690.
29. Bobbio, E., Bollano, E., Esmaily, S., Thomsen, C., Noborn, F., Sihlbom, C. et al. Clinical Diagnosis and Subtyping of Cardiac Amyloidosis by Mass Spectrometry. J Heart Lung Translplant, 2020, 39 (4, Supplement), S234-S235.
30. López-Sainz, Á., Hernandez-Hernandez, A., Gonzalez-Lopez, E., Domínguez, F., Restrepo- Cordoba, M.A., Cobo-Marcos, M. et al. Clinical profile and outcome of cardiac amyloidosis in a Spanish referral center. Rev Esp Cardiol (Engl Ed), 2021, 74 (2), 149-158.
31. Noborn, F., Thomsen, C., Vorontsov, E., Bobbio, E., Sihlbom, C., Nilsson, J. et al. Subtyping of cardiac amyloidosis by mass spectrometry-based proteomics of endomyocardial biopsies. Amyloid, 2022, 1-13.